Signal Transduct Target Ther：Palmitoylation regulates myelination by modulating the ZDHHC3-Cadm4 axis in the central nervous system.
DOI: 10.1038/s41392-024-01971-5
发布时间：2024年9月
关键技术：修饰组学、位点突变、snRNA-seq
研究背景：
髓鞘形成对神经功能至关重要，其异常会导致严重的神经退行性疾病。Cadm4在髓鞘形成中发挥关键作用，但其调控机制有待阐明。棕榈酰化作为一种重要的翻译后修饰，可能参与调控Cadm4的功能。ZDHHC3是ZDHHC家族中的一员，可能作为Cadm4的棕榈酰基转移酶，介导其棕榈酰化。基于此，本研究旨在探究ZDHHC3介导的Cadm4棕榈酰化在CNS髓鞘形成中的作用及其分子机制，并评估其在神经炎症和脱髓鞘疾病中的潜在病理学意义。
文章思路：
1. 棕榈酰化修饰组学结合Acyl-RAC分析法和mPEG标记实验，在Cadm4第347位半胱氨酸（C347）上发生了特异性的单一位点棕榈酰化修饰；
2. 采用生化实验探究证实C347位点的棕榈酰化对于Cadm4稳定定位于细胞质膜（PM）至关重要。阻断该修饰会导致Cadm4从质膜内化形成囊泡，并最终通过自噬-溶酶体途径被降解；
3. 利用CRISPR/Cas9技术构建Cadm4-C347A点突变（Cadm4-KI）小鼠模型，发现在体内阻断Cadm4棕榈酰化会导致严重的中枢神经系统髓鞘异常（如髓鞘丢失、脱髓鞘、过度髓鞘化及g-ratio降低）；
4. 构建ZDHHC3敲除（ZDHHC3-KO）细胞系及ZDHHC3-KO小鼠模型，筛选出负责催化 Cadm4 棕榈酰化的关键酶ZDHHC3；
5. 建立LPS诱导的神经炎症小鼠模型、EAE模型以及LPC诱导的局部可逆脱髓鞘模型，通过分子实验发现ZDHHC3的表达和Cadm4的棕榈酰化水平均显著下调，这表明ZDHHC3-Cadm4信号传导轴的失调不仅是髓鞘病变的原因，更可能是多种神经炎症性脱髓鞘疾病的共同病理机制；
6. snRNA-seq及生化实验表明，Cadm4主要表达于少突胶质前体细胞（OPCs）和少突胶质细胞中。Cadm4棕榈酰化的下调会异常激活 WNT/β-Catenin 信号通路（导致下游 β-Catenin异常稳定与核转位），从而抑制OPCs的正常分化，这种脱髓鞘及分化障碍最终削弱了兴奋性突触神经传递，并导致小鼠出现学习、记忆受损等认知行为缺陷。
主要研究结果：
1. 蛋白质棕榈酰化是CNS髓鞘形成所必需的
研究者首先利用广谱棕榈酰化抑制剂 2-BP 处理原代少突胶质细胞，发现髓鞘相关蛋白（如MBP）表达显著降低。通过对24种ZDHHC家族成员进行表达图谱分析，发现 ZDHHC3 在OL成熟过程中表达显著上调，提示其可能发挥关键作用。
2. 少突胶质细胞中ZDHHC3的缺失导致小鼠髓鞘发育不良
通过构建少突胶质细胞谱系特异性敲除小鼠（Olig2-Cre; Zdhhc3^fl/fl），研究发现：敲除小鼠出现明显的神经系统表型，如震颤和运动协调能力下降。透射电镜（TEM）显示，小鼠脑内（如胼胝体、视神经）髓鞘厚度显著降低（g-ratio增大），未包裹轴突比例增加。
3. 鉴定Cadm4为ZDHHC3在少突胶质细胞中的关键底物
研究者利用酰基生物素交换法（ABE）结合质谱联用技术，在少突胶质细胞中筛选受ZDHHC3调控的底物。结果锁定在细胞粘附分子 Cadm4（Cell Adhesion Molecule 4）上。实验证实，ZDHHC3能与Cadm4直接结合并催化其棕榈酰化。
4. 棕榈酰化通过抑制溶酶体降解维持Cadm4的稳定性
通过定点突变，研究者鉴定出Cadm4的棕榈酰化位点位于 Cys304 和 Cys307。当这两个位点发生突变（C304/307S）后：Cadm4的棕榈酰化水平丧失。Cadm4蛋白质稳定性显著下降，通过溶酶体途径加速降解。
5. Cadm4的棕榈酰化促进其在轴突-胶质界面的准确定位
Cadm4在OL与轴突的接触点富集是介导包裹的关键。研究发现，非棕榈酰化的Cadm4无法在质膜上正常分布，导致OL突起包裹轴突的能力受损。在敲除ZDHHC3的细胞中回补野生型Cadm4可部分恢复髓鞘形成，而回补不具棕榈酰化能力的突变体则无效。
本研究通过整合细胞生物学、分子生物学和动物模型等多方面证据，首次揭示了蛋白质棕榈酰化在调控中枢神经系统髓鞘形成中的关键作用。具体而言，文章明确指出ZDHHC3是Cadm4的关键棕榈酰基转移酶，通过催化Cadm4在Cys347位点的棕榈酰化，维持Cadm4在细胞膜上的正常定位、提高其蛋白稳定性，并促进其与其他Cadms和髓鞘相关蛋白的相互作用。
机制上，ZDHHC3介导的Cadm4棕榈酰化调控少突胶质细胞分化，可能是通过影响WNT-β-Catenin信号通路来实现的。棕榈酰化缺陷的Cadm4或ZDHHC3的缺失会导致β-Catenin的异常激活，进而抑制少突胶质细胞的成熟和髓鞘的生成。
更重要的是，本研究通过构建Cadm4棕榈酰化缺陷小鼠和ZDHHC3敲除小鼠，在体内重现了髓鞘形成障碍的表型，并且这些小鼠的髓鞘损伤与脱髓鞘疾病的病理特征高度相似。此外，研究还发现ZDHHC3-Cadm4轴的失调在神经炎症和脱髓鞘疾病模型中普遍存在，提示其可能是一个共同的病理机制。
本文章完美展示了分子生物学如何从表型出发，最终回归到精确的蛋白质生化机制，是理解神经细胞发育与蛋白质修饰关系的经典之作。
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