1. 技术定义
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是在常规PCR基础上，通过加入荧光基团（如SYBR Green染料或TaqMan探针），实时监测PCR扩增过程中荧光信号的累积，实现基因表达水平的精准定量。分为染料法（SYBR Green，非特异性结合双链DNA，成本低）与探针法（TaqMan，特异性结合目标序列，准确性高），可通过Ct值（荧光信号达到阈值时的循环数）计算目标基因的相对表达量（2^-ΔΔCt法）或绝对表达量（标准曲线法）。
2. 技术流程
3. 核心应用
基因表达定量：检测不同样本中目标基因的表达差异。
差异基因验证：验证转录组测序筛选的差异表达基因，提高结果可靠性。
病原体检测：定量检测病毒/细菌的核酸拷贝数。
基因编辑效率评估：检测CRISPR/Cas9基因编辑后目标基因的编辑效率。
4. 样本要求
样本类型 | 最低用量 | 保存条件 | 质量要求 | 注意事项 |
组织样本 | 30mg （约绿豆大） | 液氮速冻后-80℃冷冻 | RNA纯度 OD260/280=1.8-2.2，RIN 值≥7.0 | 避免脂肪组织，取样后5min内冷冻 |
细胞样本 | 1×105个 | 加Trizol后-80℃冷冻 | RNA无降解，无基因组DNA污染 | Trizol用量按 1×106细胞加 1mL比例 |
全血样本 | 200μL （EDTA抗凝） | 加RNA保存液后 | 无溶血，RNA完整性好 | 保存液与血液比例1:5，避免RNA降解 |
FFPE样本 | 3张 （4μm切片） | 室温保存 | RNA浓度≥10ng/μL，片段长度≥100bp | 切片需无甲醛残留，用专用试剂盒提取RNA |
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